B族链球菌（groupB Streptococcus，GBS）因细胞壁中多糖物质属于抗原构造分类中的B族而得名B族链球菌，又称无乳链球菌，是一种条件致病菌，研究表明GBS是围生期感染的首要病原菌之一^［1－2］。目前我国许多医院开展了GBS的产前筛查工作，以避免围生期GBS感染对产妇和新生儿带来的危害。为了有效提高GBS的筛查阳性率，寻找特异、灵敏、快速的检测方法显得尤为重要。下面就简述一下GBS不同检测方法的应用评价。

根据链球菌在培养基上生长繁殖是否溶血分为α(不完全溶血)、β(完全溶血)、γ(不溶血)三类。β溶血性链球菌又根据其抗原性分为18个菌族，其中B族链球菌与人类感染密切相关。B族链球菌为需氧型革兰阳性链球菌，表面结构复杂，包括覆盖在B族链球菌表面的荚膜多糖、内层的肽聚糖和细胞膜。荚膜多糖是B族链球菌的保护性抗原，根据荚膜抗原性将B族链球菌分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ10种血清型^［8］，其中Ⅰa多见于育龄女性，而Ⅲ型毒性最强。GBS的毒性和侵袭力主要来自其荚膜结构及其产生的神经氨酸酶和脂磷壁酸，GBS产生的其他毒性因子包括溶血素、环磷酸腺苷、马尿酸酶、核酸酶和蛋白酶等^［3］。

标本采集

阴道拭子采集：将无菌拭子放置于女性生殖道低位1/3处，沿生殖道壁轻轻旋转取得阴道分泌物。

肛周拭子采集：小心将无菌拭子插入肛门，在肛门括约肌约2～5cm处，沿肠壁轻轻旋转取得肛周分泌物。

检测方法

将采集的拭子直接接种在血平板上，置于35℃、5%CO₂条件下避光孵育18～24h，观察菌落形态，在血平板上B族链球菌菌落特点一般呈灰色、扁平、半透明或不透明、表面光滑、凸起、菌落干燥，呈不易乳化、β－溶血环（少数菌株无溶血环），对可疑菌落进行涂片镜检，并进行相应的鉴定试验，鉴定试验包括触酶试验、杆菌肽试验、CAMP试验。挑取纯菌落进行上机鉴定及药敏试验。直接培养法是最简单、对实验室要求最低的方法，特异性好，不需要特殊的仪器设备，基层实验室均能完成，但是阳性检出率低，由于阴道分泌物中含有多种正常菌群，在普通血平板培养基中，该类细菌繁殖较快，当GBS含量较少时，可能因杂菌过度生长导致GBS的生长受到抑制，其他菌落将GBS菌落覆盖或者将其抑制而无法生长，致使无法分离出GBS菌落，导致其阳性检出率较低^［4］。

将采集的拭子放入选择性肉汤增菌小瓶内充分混匀后，37℃、5%～10%CO₂培养箱内温育18～24h后，转种培养平皿，之后的操作同上。与直接培养法比较，增菌后再培养的GBS检出率明显提高，而且经GBS增菌肉汤增菌后培养基上的非目标菌受抑制，GBS增量且易于辨认。有学者提出让临床医生取完样本后直接置入增菌肉汤中等待送检，这样也避免了常规样本取材后因不能立即送检，导致拭子干燥，致使GBS出现部分死亡。美国美国疾病控制中心在2010版《围生期B族链球菌感染及预防指南》中推荐应用含庆大霉素和奈啶酸或其他抗生素的TH肉汤（Thioglycolatebroth）对阴道和直肠中GBS进行选择性增菌，肉汤中的抗生素能抑制样本中大部分革兰阴性菌的生长，而其中有助于链球菌生长的营养成分可促进GBS生长，从而显著提高GBS检出率，但是，选择性增菌肉汤培养基价格昂贵且不易获得，自行配置较麻烦，而且用选择性肉汤增菌培养，需要转种耗时长等原因，许多医院不愿使用，而普通细菌培养法仍是目前国内大多数医院首选的检测方法^［4］。

在35℃、5%CO₂条件下避光孵育18～24h，若标本中有GBS的存在，菌落显示为特定的颜色，该方法可检测溶血和不溶血的GBS，集细菌分离培养鉴定为一体，操作简单，结合增菌肉汤可提高阳性率。GBS专用显色培养基中添加了人工合成的特异性的酶底物，经GBS的酶解作用释放出显色原而显色，在GBS显色培养基上非目标菌群（大多为肠球菌、酵母样真菌、其他链球菌）集中表现为蓝色、蓝－灰、蓝－紫和淡绿色等菌落^［5］。这些菌落在培养24h时大多被抑制或生长细小，培养48h会有部分生长，但与目标菌B族链球菌的中等大小浅红至红的典型菌落区分明显，因此提高了B族链球菌的检出率。但是，在显色平板上也有一些球菌类菌落，在平板上菌落颜色和形态类似GBS，亦呈紫红色，这就需要我们加以鉴别区分了。

GBS转运培养管具有集采集、保存、运输及筛检于一身的优点，临床医生用专用的拭子采集标本后直接插入转运培养管内的琼脂内，检验人员不需要将标本接种于培养基，将该培养管放置37℃、5%～10%CO₂培养箱内温育18～24h后，观察培养基内颜色变化即可，从而减少了转运及保存及接种过程中各种不当操作所造成的干扰，当存在GBS携带时，经18～24h培养后，培养基变为胡萝卜色，否则不变色，颜色为黄色，但是，非β溶血的GBS菌株因不产生酶，故不能分解底物产生颜色变化，会导致假阴性^［5］。

按照厂商试剂盒说明，进行抗原抽提，将试剂盒内检测卡从铝箔袋取出，向样品孔内垂直滴加处理好的样本液。10～15min后观察检测结果。检测线（T线）出现红色条带，并且质控线（C线）出现，则为阳性。检测线（T线）不出现，并且质控线（C线）出现，则为阴性。如质控线（C线）不出现，则需重新进行试验。试验分别以ATCC12386无乳链球菌、ATCC19615化脓链球菌作为阳性、阴性对照^［6］。

免疫层析法相对于前面的方法而言，操作简单，无需特殊设备，出结果时间短至20分钟，其缺点是检测的灵敏度和特异性相对较差，尤其是菌量少的时候。

也是检测GBS的抗原，检测原理是吸附了抗GBS荚膜多糖抗体的胶乳混悬液与GBS荚膜多糖抗原发生反应产生凝集现象，将标本用选择性肉汤增菌后，可以提高检测的敏感性，该方法操作简单且成本相对较低，适用于社区医院或紧急情况下快速检测GBS^［7］。

蔡晓沂，钟镐镐，王秀艳等人采用聚合酶链式反应（PCR）结合分子信标探针技术对B族链球菌基因中保守序列进行检测，使用实时荧光PCR仪检测荧光强度，从而判断是否感染B族链球菌，本方法快速简便，从核酸提取到检测结果的得出，只需2~4h，适于在临分娩前对孕妇进行B族链球菌的快速筛查，能做到及时和避免重复操作^［7］。根据荚膜多糖和抗原特性差异，GBS可分为10型（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ）血清型菌株，全球主要流行的血清型为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型，其中以Ⅲ型的危害最大。多位点序列分型（multilocussequencetyping，MLST）技术，是近年来对细菌及其他病原体基因型进行鉴定的重要方法之一。郭丹，曹雪莲，温国明等人报道了血清分型：利用PCＲ技术对GBS基因组DNA荚膜多糖基因进行扩增，通过扩增出的多个基因条带对GBS的血清型别（包括Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ）进行鉴定。MLST分型：利用PCＲ扩增的方法扩增GBS的7个管家基因（adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK和tkt）。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序部进行测序。将序列提交到多位点序列分型国际网站数据库（http：//pubmlst．org/sagalactiae/）确定等位基因型和序列分型（sequencetyping，ST）^［8］监测孕妇GBS菌株的血清型分布可以为疫苗研发提供重要的基础数据。PCＲ筛选的优点是快速、准确、实时，适用于产程中孕妇GBS定植情况不明且无其他高危因素时的快速筛查，缺点是需要专门的实验室，操作易受污染，检测人员需要培训，且成本昂贵，不适合在中小医院推广，另外该类方法也缺乏抗生素敏感性数据，对青霉素过敏的孕妇依然需用培养法进行药敏。

顾克洲等人提到了快速荧光抗体测定法、对流免疫电泳法、乳胶凝集试验、协同凝集反应、长链反应、改良的CAMP反应，大多数试验仍需先培养出纯菌落，再进行鉴定^［9］。Binghuai等^［10］将B族链球菌显色培养基培养后的细菌再用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行鉴定，发现两者联合对孕晚期GBS筛查具有准确、快速（鉴定时间仅1～2min）的特点。该技术具有高通量、样本用量少、操作简单、快速的优点；缺点是需要专门的质谱仪、标本需要先培养再用质谱鉴定、无药物敏感结果。

小结

B族链球菌是引起妊娠期孕妇严重感染的主要致病菌，是导致围产期感染的主要致病菌，B族链球菌感染可增加胎膜早破、产褥感染、早产、新生儿感染、败血症等不良妊娠结局的发生。B族链球菌对绒毛膜有超强的吸附力和穿透力，容易引起胎膜早破，导致继发宫腔感染，B族链球菌在一定程度上可引起细胞因子、前列腺素、磷脂酶A2等的释放，从而引起宫缩的发生，增加早产的发生率^［11］。所以围生期GBS筛查具有重要的临床意义，研究资料表明，我国对GBS筛查相对较为滞后，还处于起步阶段，目前尚未纳入产前常规筛查范畴。GBS检测有很多方法，本研究主要进行了GBS检测方法优劣性比对，了解在GBS检测过程中各种检测方法的特性，结合当地医院的条件，选择适合GBS生长并且易于其筛选分离鉴定的方法，以逐步提高该地区B族链球菌的阳性检出率，从而达到有效预防B族链球菌对于产妇及新生儿的危害，降低新生儿的致残率及病死率。

作者：山西省长治市人民医院检验科  李晓伟

审稿：山西省长治市人民医院检验科  赵先进